RJ11723人γ干擾素(IFN-γ)ELISA檢測(cè)試劑盒

干擾素（ IFN-γ ,  又稱(chēng)  II  型干擾素或免疫干擾素）是一種主要由T淋巴細(xì)胞 和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。該蛋白與IFN-β或各種IFN-α家族蛋白沒(méi) 有明顯的同源性。成熟的  IFN-γ以非共價(jià)連接的同質(zhì)體存在。人類(lèi)IFN-γ具 有高度的物種特異性 ，只在人類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)細(xì)胞中具有生物活性。IFN-γ最初 是基于其抗病毒活性而被定性的。該蛋白還發(fā)揮抗增殖、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)炎 癥的活性 ， 因此在宿主防御機(jī)制中很重要。IFN-γ誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生 ，上 調(diào) I  類(lèi)和 II  類(lèi)  MHC  抗原、Fc  受體和白細(xì)胞粘附分子的表達(dá)。它調(diào)節(jié)巨 噬細(xì)胞的效應(yīng)功能 ，影響異型轉(zhuǎn)換并增強(qiáng) B  細(xì)胞分泌免疫球蛋白的能力。

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA） 。往預(yù)先包被有人 γ干擾素(IFN-γ)捕獲抗體的微孔中 ，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記的檢 測(cè)抗體 ，HRP酶結(jié)合物 ， 中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌 ，用底物TMB顯色 ，TMB在過(guò) 氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色 ，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色 的深淺和樣本中的人γ干擾素(IFN-γ)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm  波長(zhǎng)下測(cè) 定吸光度（ OD值） ，計(jì)算樣本濃度。

靈敏度：0.54pg/mL

特異性：可檢測(cè)樣本中人的IFN-γ ,  且與其類(lèi)似物無(wú)明顯交叉反應(yīng)

1.    試劑盒檢測(cè)范圍不等同于樣本中待測(cè)物的濃度范圍 ，建議實(shí)驗(yàn)前通過(guò)相 關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測(cè)物的濃度并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本的實(shí)際濃度。如 果樣本中待測(cè)物濃度過(guò)高或過(guò)低 ，請(qǐng)對(duì)樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。

2.    若所檢樣本不在說(shuō)明書(shū)所列樣本類(lèi)型之中 ，建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其檢測(cè)有 效性。

3.    血清 ：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時(shí)或2-8℃過(guò)夜 ，    然后1000×g離心20分鐘 ，取上清即可 ，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃或-80℃保存， 但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4.    血漿 ：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集樣本 ，并將樣本在采集后的30分  鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘 ，取上清即可檢測(cè) ，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20℃ 或-80℃保存 ，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

5.    組織勻漿 ：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織 ，去除殘留血液（勻  漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果） ，稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組 織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比 ，比如1g的組織樣本對(duì)應(yīng) 9mL的PBS ，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整 ，并做好記錄。推薦在  PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中 ，于冰上充分研磨或勻漿  機(jī)研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞 ，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎 ，或反 復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~ 10分鐘 ，取上清檢測(cè)。

6.    細(xì)胞培養(yǎng)物上清 ：請(qǐng)1000×g離心20分鐘 ，取上清即可檢測(cè) ，或?qū)⑸锨?/span>

置于-20℃或-80℃保存 ，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

7.    細(xì)胞裂解液 ：貼壁細(xì)胞用預(yù)冷PBS輕輕清洗 ，然后用胰蛋白酶消化，

1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞   用預(yù)冷PBS清洗3次 ，每1×10^6個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL PBS重懸（推     薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當(dāng)減少PBS體積）并通    過(guò)反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。將提取液于2-8℃ ,  1500×g離心10分鐘， 取上清檢測(cè)。

8.    其它生物樣本： 1000×g離心20分鐘 ，取上清即可檢測(cè)。

9.    樣本外觀 ：樣本應(yīng)清澈透明 ，懸浮物應(yīng)離心去除。

10.  樣本保存 ：樣本收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃ ,  若不能及時(shí) 檢測(cè) ，請(qǐng)按一次使用量分裝 ，凍存于-20℃（ 1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)） ，或-80℃    （ 6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)） ，避免反復(fù)凍融 ，樣本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果 ， 因   此溶血樣本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

 請(qǐng)?zhí)崆邦A(yù)估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測(cè)樣本需要稀釋 ，參考稀釋方案如下：

稀釋 100 倍：一步稀釋。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 100 倍稀釋?zhuān)?/span>

稀釋 1000 倍 ：兩步稀釋。取 5μL 樣本到 95μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 20 倍稀釋 ， 再取 5μL 20 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ， 做 50 倍稀釋 ， 總共稀釋 1000 倍；

稀釋 100000 倍 ：三步稀釋。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 40 倍稀 釋 ，再取 5μL 40 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 50 倍稀釋 ，最后取 5 μL 2000 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內(nèi) ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 100000 倍；

每步稀釋時(shí)取液量不少于 3μL ，稀釋倍數(shù)不超過(guò) 100 倍。每步稀釋都需混合均 勻 ，避免起泡。

1.    請(qǐng)?zhí)崆?/span>從冰箱中取出試劑盒 ，平衡至室溫。

2.    標(biāo)準(zhǔn)品梯度工作液配制：加入 1mL  通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中 ，靜置15 分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為100pg/mL)，然后按照以下濃度：

100pg/mL、 50pg/mL、25pg/mL、 12.5pg/mL、6.25pg/mL、3. 12pg/mL、

1.56pg/mL、0pg/mL進(jìn)行稀釋。

倍比稀釋方法 ：取7支EP管 ，每管中加入500μL通用稀釋液, 100pg/mL  的    標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成50pg/mL  的標(biāo)準(zhǔn)品工 作液 ，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔 ，不需要再 從倒數(shù)第二管中吸取液體 ，具體如下圖。

3.    生物素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將100×濃縮生物素化檢抗于  1000×g離心1分鐘 ，以通用稀釋液將100×濃縮生物素化檢抗稀釋成1×工 作濃度(例： 10μL濃縮液+990μL通用稀釋液) ，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.    酶結(jié)合物工作液配制 ：使用前15分鐘將100×濃縮酶結(jié)合物于1000×g離 心1分鐘 ，以通用稀釋液將100×濃縮酶結(jié)合物稀釋成1×工作濃度(例： 10 μL濃縮液+990μL通用稀釋液) ，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5.    1×洗滌液配制：取10mL 20×洗滌液到190mL蒸餾水中（從冰箱中取出的 濃縮洗滌液可能有結(jié)晶 ，屬于正常現(xiàn)象 ，可放置室溫 ，待結(jié)晶溶解 后再配制)。

操作步驟：

1.    從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條 ，剩余板條用自封袋密封 放回4℃。

2.    加樣 ：分別將樣本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μL每孔加入相應(yīng)孔中 ，空 白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。（建議：

將待測(cè)樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測(cè)試。從而減   少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響 ，最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對(duì)應(yīng)的稀釋 倍數(shù)。所有的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中建議設(shè)立復(fù)孔）。

3.    加生物素化檢抗 ：取出酶標(biāo)板 ，棄去液體 ，不用洗滌。每孔直接加入

100μL生物素化檢抗工作液 ，蓋上封板膜后37℃溫育60分鐘。

4.    洗板 ：棄去液體 ，每孔加入300μL 1x洗滌液 ，靜置1分鐘 ，甩去洗滌液， 吸水紙上拍干 ，如此重復(fù)洗板3次（也可用洗板機(jī)洗板）。

5.    加酶結(jié)合物工作液 ：每孔加入100μL酶結(jié)合物工作液 ，蓋上封板膜后 37℃溫育30分鐘。

6.    洗板 ：棄去液體按步驟4洗滌方法 ，洗板5次。

7.    加底物 ：每孔加入90μL底物(TMB) ，蓋上封板膜 ，37℃避光溫育15分鐘。

8.    加終止液 ：取出酶標(biāo)板 ，每孔直接加入50μL終止液 ，立即在450nm波長(zhǎng) 處測(cè)定各孔的OD值。

結(jié)果判斷：

1.    計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均  OD  值并減去空白孔的  OD  值作為校 正值。 以濃度為橫坐標(biāo) ，OD  值為縱坐標(biāo) ，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參 數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.    若樣本 OD  值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限 ，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度 時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)據(jù)和參考曲線：

以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考 ，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

注意 ：本圖僅供參考 ，應(yīng)以每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本含量。

1.    重復(fù)性 ：板內(nèi)變異系數(shù)小于  10% ，板間變異系數(shù)小于  10%。

2.    回收率 ：在選取的健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入  3  個(gè)不同 濃度水平的人IFN-γ ,  計(jì)算回收率。

3.    線性稀釋?zhuān)悍謩e在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入

高濃度人IFN-γ ,  在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋 ，評(píng)估線性。