人胰島素原(PI)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明

PI簡介：

胰島素原(PI)是胰島素的前體激素，它是由由胰島β細胞合成和分泌，主要在腎臟分解代謝。生理情況下，只有極少量的胰島素原釋放入血，在病理情況下，胰島β細胞釋放胰島素原增多，血中胰島素原水平升高。它是細胞在裂解成成熟胰島素之前分泌的最后一個單鏈蛋白結構。它是由芝加哥大學的Donald F. Steiner教授在1967年發現的。

實驗原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被有人胰島素原（PI）捕獲抗體的微孔中，依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體，HRP酶結合物，中間經過溫育和洗滌，用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素原（PI）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成：

試劑盒參數：

需自備的設備及試劑： 

1. 450±10nm 濾光片酶標儀

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移液器.

4. 蒸餾水或去離子水.

5. 脫脂棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準備若干個標準品稀釋管.

樣本稀釋方案：

請提前預估樣本的濃度范圍 ，如果您的檢測樣本需要稀釋 ，參考稀釋方案如下：

稀釋 100 倍 ：一步稀釋。取 5μL 樣本到 495μL 通用稀釋液內 ，做 100 倍稀釋；

稀釋 1000 倍： 兩步稀釋 。 取 5μL 樣本到 95μL 通用稀釋液內 ，做 20 倍稀 釋 ，再取 5μL 20 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋 1000 倍；

稀釋 100000 倍 ：三步稀釋。取 5μL 樣本到 195μL 通用稀釋液內 ，做 40 倍 稀釋 ，再取 5μL 40 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，最后 取 5μL 2000 倍稀釋樣本到 245μL 通用稀釋液內 ，做 50 倍稀釋 ，總共稀釋100000 倍；

每步稀釋時取液量不少于 3μL ，稀釋倍數不超過 100 倍。每步稀釋都需混合均勻 ，避免起泡。

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4. 細胞培養物上清：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

5. 其它生物標本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6. 樣品外觀：樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7. 樣品保存：樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

檢測前準備工作：

1. 請提10分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

標準品梯度工作液配制：加入1mL通用稀釋液至凍干標準品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為800pg/mL)，然后按照以下濃度：800pg/mL、400pg/mL、200pg/mL、 100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、 12.5pg/mL、0pg/mL進行稀釋。

倍比稀釋方法：取7支 EP管，每管中加入500μL通用稀釋液,200pg/mL的標準品工作液中吸取500μL到第一支EP管中混勻配成100pg/mL的標準品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再從倒數第二管中吸取液體，具體如下圖。

1. 生物素化檢抗工作液配制：使用前15分鐘將濃縮生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮生物素化抗體稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當日使用。

2. 酶結合物工作液配制：使用前15分鐘將100x濃縮酶結合物于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮HRP酶結合物稀釋成1×工作濃度(例：10μL濃縮液+990μL通用稀釋液)，當日使用。

3. 1×洗滌液配制：取10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可放置室溫，輕搖均勻，待結晶溶解后再配置)。

操作步驟：

1. 從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2. 加樣：分別將樣品或不同濃度標準品按照100μl每孔加入相應孔中，空白孔加入100μL通用稀釋液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時。（建議：將待測樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標板內測試。從而減少基質效應對測試結果的誤差影響，最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和標準品在檢測中建議設立復孔）。

3. 加生物素化抗體：取出酶標板，棄去液體，不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液100μL，蓋上封板膜后37℃溫育1小時。

4. 洗板：棄去液體，每孔加入300μL 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板3次（也可用洗板機洗板）。

5. 加酶結合物工作液：每孔加入酶結合物工作液100μL，蓋上封板膜后37℃溫育30分鐘。

6. 洗板：棄去液體按步驟4洗滌方法，洗板5次。

7. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。

8.  加終止液：取出酶標板，每孔直接加入終止液50μL，立即在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷：

1. 計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。

典型數據和參考曲線：

以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

試劑盒性能：

1. 重復性：板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。

2. 回收率：在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入3個不同濃度水平的人PI，計算回收率

3. 線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人PI，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。評估線性。